一、Thu thập mẫu
Dùng bông gòn vô trùng thấm dịch buffer sunfat phốt phát để thụt trực tràng nếu không có phân.4~6cm (trẻ em)2~3cm) ở trực tràng, sau khi quét lấy dịch niêm mạc bề mặt trực tràng, lấy ra và đựng trong dịch vận chuyển hoặc bảo quản, nếu không thể gửi kiểm tra kịp thời, mẫu cần được bảo quản trong4℃ bảo quản lạnh, nhưng không vượt quá8giờ là phù hợp.
二、Tăng trùng và nuôi cấy tách ly
Đối với việc tách ly E. coli, cần sử dụng môi trường chọn lọc yếu trong bước tách ban đầu, chẳng hạn như môi trường选择性 Eosin Methylene Blue,平板 China Blue Sorbitol MacConkey, chia theo dòng,35~37℃ nuôi cấy18~24giờ sau, quan sát đặc điểm hình thái của khuẩn lạc, chọn hồng hoặc đỏ sẫm, kích thước1~3mm, viền đều và sáng, khuẩn lạc đơn vị nổi lên ở trung tâm được xác định.
Ba、Xác định
1、Xác định ban đầu:Dựa trên đặc điểm của khuẩn lạc, hình dáng và phản ứng nhuộm của khuẩn lạc, lấy mẫu vi khuẩn nuôi cấy tinh khiết để thực hiện phản ứng sinh hóa, tất cả những kết quả phù hợp có thể xác định ban đầu là Escherichia coli.
2、Xác định cuối cùng:Kiểm tra thông thường cần thực hiện đến bước xác định ban đầu như trên, nếu cần thiết có thể xác định cuối cùng theo phản ứng sinh hóa được liệt kê trong Sách tay cận lâm sàng vi khuẩn hệ thống Bergey.
3、thử nghiệm xác định: }}certain E.coli, especially non-motile lactose non-fermenting strains, should be differentiated from Shigella, the main differential tests are sodium acetate and glucose amine utilization test and acid production from mucate3loại thử nghiệm, E.coli đều dương tính, trong khi Shigella âm tính.
(1)E.coli gây bệnh:
A、thử nghiệm giả: chọn các khu vực khuẩn lạc mọc dày trên đĩa phân biệt, lấy mẫu nuôi dưỡng bằng EPEC3loại huyết thanh O đa giá để thực hiện thử nghiệm tụ huyết cầu trên kính, nếu tụ huyết cầu với một loại huyết thanh O đa giá nào đó, sau đó thực hiện thử nghiệm với huyết thanh đơn O trong huyết thanh đa giá đó, nếu tụ huyết cầu với một huyết thanh đơn O nào đó, sau đó chọn3~5l khuẩn lạc đơn lẻ, thực hiện thử nghiệm tụ huyết cầu với huyết thanh đó.
B、thử nghiệm hóa sinh: chọn các khu vực có khuẩn lạc có khả năng đông cứng mạnh của huyết thanh đơn O,接种 vào琼脂 ba đường glucose, treo giấy thử indole, sau khi36℃ nuôi cấy18~20h, bất kỳ lactose, sucrose tạo acid, glucose tạo acid và tạo khí nhiều, H2S âm tính, indole dương tính, có thể xác nhận là E.coli, nếu indole âm tính, còn phải kiểm tra thêm V-Kết quả thử nghiệm P âm tính và không thể mọc trên dày gel natri citrat Simmon, mới có thể xác nhận là E.coli.
C、thử nghiệm xác nhận học miễn dịch: gạt lấy vi sinh vật từ琼脂 ba đường glucose, chế tạo suspension vi sinh vật bằng nước muối sinh lý, loãng đến nồng độ tương đương với MacFarland3so với nồng độ tương đương của ống loãng so với số lượng vi sinh vật, nếu hiệu价 ban đầu của huyết thanh đơn là1∶(160~320), thì có thể1∶40 loãng (sử dụng 0.5% nước muối), trong10mm×75mm ống thử, trộn đều dịch huyết thanh được loãng với suspension vi sinh vật, ở50.6℃ nước.16h sau khi quan sát kết quả, nếu xuất hiện tụ huyết cầu, có thể xác nhận là O因子 này.
(2)E.coli gây xuất huyết: được biết là phân của bệnh nhân bị viêm ruột xuất huyết, có thể vẽ đường接种 vào đĩa MacConkey琼脂 thay thế lactose bằng sorbitol, sau khi nuôi cấy, chọn3~5l khuẩn lạc không lên men sorbitol, sử dụng O157Serum (tốt nhất là thêm H7Serum) làm thử nghiệm tụ huyết cầu trên kính và thử nghiệm tụ huyết cầu đơn ống để xác định chẩn đoán.
Các菌株 được tách ra nên được接种 vào琼脂 ba đường glucose, treo giấy thử indole, sau khi36℃ nuôi cấy18~20h, đặc điểm hóa sinh典型 là lactose, sucrose tạo acid, glucose tạo acid và tạo khí nhiều, H2S âm tính, indole dương tính, và đã接种 ống lên men sorbitol, là lên men chậm.
(3)E.coli gây độc:
A、生化试验: trên đĩa phân biệt, chọn các khu vực có khuẩn lạc có thể đông cứng5l所选取乳糖发酵的典型菌落,分别接种于三糖铁琼脂,悬挂靛基质试纸片,经过36℃ nuôi cấy18~20h, bất kỳ lactose, sucrose tạo acid, glucose tạo acid và tạo khí nhiều, H2S âm tính, indole dương tính, có thể xác nhận là E.coli, nếu indole âm tính, còn phải kiểm tra thêm V-Kết quả thử nghiệm P âm tính và không thể mọc trên dày gel natri citrat Simmon, mới có thể xác nhận là E.coli.
B、毒素试验: E.coli gây độc chủ yếu được xác nhận bằng thử nghiệm毒素 ruột, phương pháp thử nghiệm毒素 rất nhiều, hiện nay ở Trung Quốc, chúng ta sử dụng thử nghiệm bội trùng琼脂 để đo LT, thử nghiệm thả con chuột bạch thông qua đường miệng để đo ST, đôi khi cũng sử dụng thử nghiệm kết扎 đoạn ruột non của chó nhà để đo LT và ST.
Hiện tại đã có phương pháp chẩn đoán di truyền để đo hai độc tố ruột này.}}
a, thí nghiệm扩散琼脂 hai chiều: cấy vi khuẩn được kiểm tra theo5điểm hình tròn接种 trên đĩa Elek, thực hiện theo cách tương tự, làm hai mẫu, vào36℃ nuôi cấy48h, đặt một miếng giấy polimyxin B trên mỗi đốm vi khuẩn, vào36℃ qua5~6h, để độc tố ruột xâm nhập vào琼脂, ở khoảng cách từ màng vi khuẩn5mm ở trung tâm, làm một lỗ đường kính4mm lỗ tròn, và sử dụng một giọt琼脂 làm nền, trong lỗ tròn thêm LT antitoxin30μl, và sử dụng vi khuẩn tiết LT và không tiết độc làm đối chứng, vào36℃ nuôi cấy15~20giờ quan sát kết quả, những người có đốm trắng giữa đốm vi khuẩn và lỗ kháng độc tố được coi là dương tính, ngược lại được coi là âm tính.
b, thí nghiệm truyền dạ dày con gà non: cấy vi khuẩn được kiểm tra vào axit amin nhiễm độc của Honda, vào36℃ nuôi cấy24h,3000vòng/phút离心30phút, lấy dịch supernatant qua bộ lọc màng lọc,60℃ làm nóng30phút, mỗi ml dịch lọc thêm2% dung dịch Evans blue 0.02ml,注入 này dịch lọc qua ống nhựa nhỏ,1~4ngày tuổi của con gà non vào dạ dày,1ml, đồng thời tiêm3~4con, không ăn3~4h sau khi gây mê bằng chloroform, lấy tất cả các đoạn ruột ra, cân nặng đoạn ruột (bao gồm dịch tích lũy) và trọng lượng còn lại, tỷ lệ trọng lượng đoạn ruột và trọng lượng còn lại lớn hơn 0.09được coi là dương tính, 0.07~0.09được coi là nghi ngờ.
c, thí nghiệm gắn kết đoạn ruột thỏ: cấy vi khuẩn được kiểm tra vào axit amin nhiễm độc của Honda, vào36℃ nuôi cấy24h,3000vòng/phút离心30phút, lấy dịch supernatant qua bộ lọc màng lọc, phân dịch thành hai phần, một phần không làm nóng, cung cấp để đo LT; phần còn lại60℃ làm nóng30phút, cung cấp để đo ST, lấy trọng lượng2kg thỏ, không ăn1ngày, sau khi gây mê, phẫu thuật nội soi, lấy đoạn ruột回, theo10~15cm là một đoạn, chia đoạn và buộc chặt, lấy một đoạn tiêm axit amin,2ml làm đối chứng âm tính, đoạn khác nhau tiêm dịch lọc từ axit amin của vi khuẩn tiết độc已知,2ml làm đối chứng dương tính, các đoạn khác nhau tiêm dịch lọc từ nuôi cấy axit amin của vi khuẩn thử,2ml,缝合腹壁, khi đo ST, sau khi tiêm,6~8h kiểm tra phẫu thuật nội soi; khi đo LT, sau khi tiêm,18h kiểm tra phẫu thuật nội soi, lấy dịch từ các đoạn ruột khác nhau, đo thể tích, và đo độ dài của đoạn ruột, tỷ lệ thể tích dịch tích lũy (ml) và độ dài đoạn ruột (cm) lớn hơn1là dương tính.
d, thí nghiệm serological: các vi khuẩn dương tính với enterotoxin có thể sử dụng serum đa giá và đơn giá liên quan đến ETEC để thực hiện thí nghiệm agglutination trên玻片 để xác định O抗原.
(4)Vi khuẩn E.coli xâm nhập:
A, thí nghiệm sinh học: chọn khuẩn lạc trên đĩa phân biệt,3~5các vi khuẩn có đặc điểm giống với Shigella nhưng không发酵 lactose, nhưng các khuẩn lạc có ưu thế发酵 lactose cũng có thể chọn lấy một cách thích hợp, cấy các khuẩn lạc đã chọn vào ống bán rắn,36℃ nuôi cấy18~24vi khuẩn có động lực thường có thể bỏ qua, trừ khi được xác định serological là 0124Còn lại các vi khuẩn không có động lực, cấy lên琼脂 ba đường, treo que thử纸 của indole,36℃ nuôi cấy18~20h, đồng thời thực hiện thử nghiệm decarboxylase lysine, đặc điểm hóa học điển hình của EIEC là: lactose, sucrose không sản sinh axit hoặc sản sinh axit, glucose sản sinh axit, sản sinh khí hoặc không sản sinh khí, H2S âm tính, indole dương tính, decarboxylase lysine âm tính, ngoài O124không có động lực, thử nghiệm decarboxylase lysine cũng có thể thực hiện sau thử nghiệm miễn dịch học.
B、Thử nghiệm miễn dịch học: Lấy mẫu từ môi trường nuôi cấy ba đường saccharose, sử dụng hai loại huyết thanh đa giá O của EIEC để thực hiện thử nghiệm kết dính玻 mạch, để xác định thành phần O nguyên vẹn của nó.
C、Thử nghiệm mắt chuột rừng: Đổ dịch vi khuẩn vào mắt chuột rừng2~5ngày để quan sát có triệu chứng đỏ, sưng, chảy nước mắt không.
D、Thử nghiệm ELISA: Sử dụng vi khuẩn EIEC hoặc các chủng độc của Shigella để tiêm chủng cho thỏ, lấy huyết thanh miễn dịch được thu được bằng các chủng độc vô hiệu cùng loại để hấp thu, đo bằng phương pháp ELISA, các chủng độc của EIEC và các chủng độc của Shigella đều là dương tính, phương pháp này là để kiểm tra poly peptide xâm nhập của vi khuẩn bị kiểm tra, cũng có thể sử dụng phương pháp探针 di truyền để kiểm tra.
(5)Escherichia coli kết dính tập trung: Một trong những đặc điểm quan trọng của Escherichia coli kết dính tập trung (EAEC) là ở Hap-2vào xung quanh tế bào hình thành đặc trưng của sự dính kết tập trung, Yamamoto phát hiện rằng37℃ nuôi cấy, EAEC loại này có thể xảy ra sự dính kết ở bề mặt phát triển của một số môi trường nuôi cấy lỏng, hình thành các khối vi khuẩn dính kết mỏng manh, ở25℃ hoặc42℃ thì không có hiện tượng này, môi trường nuôi cấy lỏng sử dụng L hoặc M-H môi trường nuôi cấy tốt nhất, có thể sử dụng để xác định sơ bộ EAEC, thử nghiệm hình thành khối vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy lỏng: vi khuẩn Escherichia coli接种 vào M-H môi trường nuôi cấy lỏng (Difco),35~37℃ ủ18~24h, bất kỳ ai có khối vi khuẩn hình thành ở bề mặt (phần nào chìm xuống đáy ống) đều là dương tính, không có khối vi khuẩn mờ đều đều là âm tính,1996năm Wang Mei và đồng nghiệp đã nghiên cứu về sự kết dính ruột-thử nghiệm sàng lọc đơn giản đối với Escherichia coli dính, sau đó sử dụng M-H培养基 trên thử nghiệm hình thành khối vi khuẩn với Hep-2so sánh với thử nghiệm gắn kết tế bào, phát hiện rằng mức độ đồng nhất của cả hai đạt77%, nếu bao gồm cả loại lan tỏa và hạn chế thì lên88.5%, cho thấy thử nghiệm hình thành khối vi khuẩn là phương pháp sàng lọc sơ bộ đáng tin cậy để phát hiện EAggEC.