一、采集标本
以无菌棉拭子蘸取腹泻病患者粪便,如无粪便,以浸湿磷酸盐缓冲液的直肠拭子插入肛门4ถึง6cm(婴幼儿2ถึง3cm)处,在直肠内旋转擦取直肠表面黏液后取出,盛于运送或保存液中,如不能及时送检,样品应在4℃冷藏保存,但以不超过8h为宜。
二、增菌和分离培养
对于大肠埃希杆菌的分离应在初代分离时选用弱选择性培养基,如伊红亚甲蓝,中国蓝蔷薇酸式山梨醇麦康凯平板,划线分离,35ถึง37℃培养18ถึง24หลังจากนั้น ตรวจสอบลักษณะของเหล็กซอง เลือกเหล็กซองสีม่วงหรือสีเข้ม ขนาด1ถึง3mm มีขอบเขตที่สมบูรณ์แบบและมีความสว่าง และมีแผ่นเหล็กซองเดี่ยวที่ยิบยอด ทำการระบุ
สาม、ระบุ
1、ระบุเริ่มต้น:ตามลักษณะของเหล็กซอง ลักษณะของการสีแบบและปฏิกิริยาสี และดึงตัวแบบที่สะอาดของบาคทีเรียที่ทำการปฏิกิริยาเชื้อเซลล์ ในทุกกรณีที่ตรงกับผลลัพธ์ที่เหมาะสม สามารถระบุเริ่มต้นว่าเป็น Escherichia coli
2、ระบุสุดท้าย:ปกติแล้ว การตรวจสอบปกติสามารถทำการระบุเริ่มต้นได้ แต่ในกรณีที่จำเป็น สามารถทำการระบุสุดท้ายตามปฏิกิริยาเชื้อเซลล์ที่ระบุในคู่มือเชื้อเซลล์ระบบเบิร์เกอร์
3、鉴定试验:某些大肠埃希杆菌,尤其是无动力的不发酵乳精株,应与志贺菌相鉴别,二者的主要鉴别试验可用醋酸钠和葡萄糖铵利用试验及黏质酸盐产酸3种试验,大肠埃希杆菌均为阳性,而志贺菌为阴性。
(1)致病性大肠埃希杆菌:
A、假定试验:于鉴别平板上菌落生长稠密处挑取培养物,以EPEC的3种多价O血清作玻片凝集试验,如与某一种多价O血清凝集,再与该多价血清所包含的O单价血清做试验,如与某个O单价血清凝集,再挑取3ถึง5个单个菌落,与该血清作凝集试验。
B、生化试验:选择O单价血清强凝集的菌落接种三糖铁琼脂,悬挂靛基质试纸片,经36℃培养18ถึง20h,凡是乳糖,蔗糖产酸,葡萄糖产酸并多数产气,H2S ผลตรวจหลังไม่เป็นตัวแทน และมีสารอินดอล สามารถยืนยันว่าเป็นแบคทีเรียอีโคลิห์ หากสารอินดอลผลตรวจหลังไม่เป็นตัวแทน ยังต้องมี V-P试验为阴性,且不能在西蒙枸橼酸盐琼脂上生长,方可证实为大肠埃希杆菌。
C、血清学证实试验:刮取三糖铁琼脂上的培养物,用生理盐水制成菌悬液,稀释至与MacFarland3号比浊管相当的浓度,0单价血清如果原效价在1∶(16ถึง320),则可10h ทุกชนิดขององค์กระเบียงที่มีการผลิตกรดองค์ สมุราถที่จะเลือกเมือกที่มีความสามารถเติบโตที่ดินแบบที่สามารถตั้งความสามารถเติบโตได้40h ทุกชนิดขององค์กระเบียงที่มีการผลิตกรดองค์ สมุราถที่จะเลือกเมือกที่มีความสามารถเติบโตที่ดินแบบที่สามารถตั้งความสามารถเติบโตได้50h ทุกชนิดขององค์กระเบียงที่มีการผลิตกรดองค์ สมุราถที่จะเลือกเมือกที่มีความสามารถเติบโตที่ดินแบบที่สามารถตั้งความสามารถเติบโตได้100h ทุกชนิดขององค์กระเบียงที่มีการผลิตกรดองค์ สมุราถที่จะเลือกเมือกที่มีความสามารถเติบโตที่ดินแบบที่สามารถตั้งความสามารถเติบโตได้750h ทุกชนิดขององค์กระเบียงที่มีการผลิตกรดองค์ สมุราถที่จะเลือกเมือกที่มีความสามารถเติบโตที่ดินแบบที่สามารถตั้งความสามารถเติบโตได้50h ทุกชนิดขององค์กระเบียงที่มีการผลิตกรดองค์ สมุราถที่จะเลือกเมือกที่มีความสามารถเติบโตที่ดินแบบที่สามารถตั้งความสามารถเติบโตได้60h ทุกชนิดขององค์กระเบียงที่มีการผลิตกรดองค์ สมุราถที่จะเลือกเมือกที่มีความสามารถเติบโตที่ดินแบบที่สามารถตั้งความสามารถเติบโตได้160h ทุกชนิดขององค์กระเบียงที่มีการผลิตกรดองค์ สมุราถที่จะเลือกเมือกที่มีความสามารถเติบโตที่ดินแบบที่สามารถตั้งความสามารถเติบโตได้
(20h ทุกชนิดขององค์กระเบียงที่มีการผลิตกรดองค์ สมุราถที่จะเลือกเมือกที่มีความสามารถเติบโตที่ดินแบบที่สามารถตั้งความสามารถเติบโตได้3ถึง50h ทุกชนิดขององค์กระเบียงที่มีการผลิตกรดองค์ สมุราถที่จะเลือกเมือกที่มีความสามารถเติบโตที่ดินแบบที่สามารถตั้งความสามารถเติบโตได้1570h ทุกชนิดขององค์กระเบียงที่มีการผลิตกรดองค์ สมุราถที่จะเลือกเมือกที่มีความสามารถเติบโตที่ดินแบบที่สามารถตั้งความสามารถเติบโตได้70h ทุกชนิดขององค์กระเบียงที่มีการผลิตกรดองค์ สมุราถที่จะเลือกเมือกที่มีความสามารถเติบโตที่ดินแบบที่สามารถตั้งความสามารถเติบโตได้
0h ทุกชนิดขององค์กระเบียงที่มีการผลิตกรดองค์ สมุราถที่จะเลือกเมือกที่มีความสามารถเติบโตที่ดินแบบที่สามารถตั้งความสามารถเติบโตได้36℃培养18ถึง20h ทุกชนิดขององค์กระเบียงที่มีการผลิตกรดองค์ สมุราถที่จะเลือกเมือกที่มีความสามารถเติบโตที่ดินแบบที่สามารถตั้งความสามารถเติบโตได้20h ทุกชนิดขององค์กระเบียงที่มีการผลิตกรดองค์ สมุราถที่จะเลือกเมือกที่มีความสามารถเติบโตที่ดินแบบที่สามารถตั้งความสามารถเติบโตได้
(3S ผลตรวจหลังไม่เป็นตัวแทน และมีสารอินดอล และทดสอบด้วยท่อทดสอบการเจริญเติบโตของซาลิซิลิ่ง จึงเป็นการเจริญเติบโตช้า
)แบคทีเรียอีโคลิห์ที่มีการผลิตกรด: ใช้เมือกที่มีความสามารถเติบโตที่ดินแบบที่สามารถตั้งความสามารถเติบโตได้5A การทดสอบชีวเคมี: ใช้เมือกที่มีความสามารถเติบโตที่ดินแบบที่สามารถตั้งความสามารถเติบโตได้36℃培养18ถึง20h ทุกชนิดขององค์กระเบียงที่มีการผลิตกรดองค์ สมุราถที่จะเลือกเมือกที่มีการเจริญเติบโตจากการทดสอบการเจริญเติบโตขององค์กระเบียงลูกหนุ่ม และทดสอบด้วยเจลแบบไทรสวาลาเพื่อตรวจสอบ2S ผลตรวจหลังไม่เป็นตัวแทน และมีสารอินดอล สามารถยืนยันว่าเป็นแบคทีเรียอีโคลิห์ หากสารอินดอลผลตรวจหลังไม่เป็นตัวแทน ยังต้องมี V-P ผลตรวจหลังไม่เป็นตัวแทน และไม่สามารถเจริญเติบโตในเจลแบบลูกฝายซิมอน จึงสามารถยืนยันว่าเป็นแบคทีเรียอีโคลิห์
B การทดสอบโปรตีโอ แบคทีเรียอีโคลิห์ที่มีการผลิตโปรตีโอเชื่อถือกันโดยการทดสอบโปรตีโอ มีวิธีหลายราย ในประเทศจีนขณะนี้ใช้วิธีการแบ่งจุลชิ้นที่มีสายละติจากเจลแบบทวิทานที่มีอุณหภูมิเย็น และใช้วิธีการใส่น้ำเหลืองแกะยางลูกหนุ่มด้วยน้ำเหลืองแกะยางลูกหนุ่มเพื่อตรวจสอบ LT และ ST บางครั้งยังใช้วิธีการหยุดมดลูกของหมูหรือหมูสาวในการตรวจสอบ LT และ ST
当前已有采用基因诊断法测定这两种肠毒素。
a、双向琼脂扩散试验:将被检菌株按5点环形接种于Elek培养基上,以同样操作,共做两份,于36℃培养48h,在每株菌的菌苔上放一片多黏菌素B纸片,于36℃经5ถึง6h,使肠毒素渗入琼脂中,在离菌苔各5mm处的中央,挖一个直径4mm的圆孔,并用一滴琼脂垫底,在孔内滴加LT抗毒素30μl,并用已知产LT和不产毒菌株作对照,于36℃培养15ถึง20h观察结果,在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性,否则为阴性。
b、乳鼠灌胃试验:将被检菌株接种于Honda产毒肉汤内,于36℃培养24h,3000r/min离心30min,取上清液经薄膜滤器过滤,60℃加热30min,每毫升滤液内加入2%伊文思蓝溶液0.02ml,将此滤液用塑料小管注入1ถึง4天龄的乳鼠胃内0.1ml,同时接种3ถึง4只,禁食3ถึง4h后用氯仿麻醉,取出全部肠管,称量肠管(包括积液)重量及剩余的体重,肠管重量与剩余体重之比大于0.09为阳性,0.07~0.09为可疑。
c、家兔结扎回肠段试验:将被检菌株接种于Honda产毒肉汤,于36℃培养24h,3000r/min离心30min,取上清液经薄膜滤器过滤,滤液分成两份,一份不加热,供测LT用;另一份60℃加热30min,供测ST用,取体重2kg家兔,禁食1天,麻醉后剖腹,取出回肠段,按10ถึง15cm为一段,分段结扎,取一段注射肉汤2ml作为阴性对照,另一段注射已知产毒菌肉汤培养物的滤液2ml作为阳性对照,其他各段分别注射待试菌株肉汤培养物的滤液2ml,将腹壁缝合,测定ST时,于注射后6ถึง8h剖腹检查;测定LT时,于注射后18h剖腹检查,抽取各肠段内的滤液,测定其容量,并测定肠段的长度,积液量(ml)与肠段长度(cm)之比大于1为阳性。
d、血清学试验:肠毒素试验阳性菌株可用ETEC有关的多价O血清及单价血清作玻片凝集试验,以确定其O抗原。
(4)侵袭性大肠埃希杆菌:
A、生化试验:于鉴别平板上挑取菌落3ถึง5个,一般应多挑取与志贺菌相似的不发酵乳糖的菌落,但发酵乳糖的优势菌落亦可适当挑取,将挑取的菌落接种半固体管,36℃培养18ถึง24h,有动力的菌株一般可以弃去,除非经血清学鉴定为0124,留下无动力的菌株,接种三糖铁琼脂,悬挂靛基质试纸片,36℃培养18ถึง20h,同时并作赖氨酸脱羧酶试验,EIEC的典型生化特性为:乳糖,蔗糖不产酸或产酸,葡萄糖产酸,产气或不产气,H2S นั้นลบ มีสารมันสารปลายหลังของไซโคลินที่เป็นบวก ลิโซไซน์เลสที่เป็นลบ ยกเว้นจาก O124ทั้งหมดที่มีสารเคมีเล็กน้อย การทดสอบการปรับแปลงลิโซไซน์ ก็สามารถทำในตอนหลังการทดสอบวิทยาศาสตร์เลือด
B. การทดสอบวิทยาศาสตร์เลือด: นำตัวเชื้อที่เติบโตบนฉันท์แบบไทรสลากเลือด ทดสอบด้วยการตรวจสอบการเคลืองแบบชิ้นแบบของสารเลือดสายพันธุ์ O สองชนิดของ EIEC เพื่อกำหนดสายพันธุ์ O ของตัวเชื้อ
C. การทดสอบตาแก้วหนู: นำเชื้อหยอดลงในตาของหนู2ถึง5วันในการตรวจสอบว่ามีอาการแดงเนื้อ บวม หรือไหลน้ำตา
D. การทดสอบ ELISA: ใช้เชื้อที่มีสารพิษของ EIEC หรือชาติพันธุ์ของสายพันธุ์ Salmonella ที่มีสารพิษต่อหนู จากนั้นใช้สารเลือดที่มีสารพิษของตัวเชื้อนี้ในการดูดทางพันธุ์ของสายพันธุ์ที่มีสารพิษที่ไม่มีพิษ ทดสอบด้วยวิธี ELISA สายพันธุ์ของ EIEC และ Salmonella ที่มีสารพิษทุกชนิดทั้งหมดจะมีผลลัพธ์เป็นบวก วิธีนี้เป็นการตรวจสอบโปรตีนโจมตีของเชื้อที่ตรวจสอบ และยังสามารถใช้วิธีแบบสำรวจดีเอ็นเอด้วย
(5) E.โคลรีที่มีการเข้ากัน: คุณสมบัติสำคัญของ E.โคลรีที่มีการเข้ากันคือ-2เซลล์ที่มีการเชื่อมตัวกันในต่อเนื่อง ซึ่งYamamoto พบว่า37°C ในการเลี้ยงเซลล์ การเชื่อมตัวของ EAEC ที่มีความเหมือนกันนี้จะเกิดขึ้นบนพื้นที่ของสารปรุงแต่งเลือดบางตัว และก่อตัวเป็นเซลล์ที่มีการเชื่อมตัวกัน25°C หรือ42°C ไม่มีปรากฏหลักฐานเช่นนี้ สารปรุงแต่งเลือดใช้ L หรือ M-H ซึ่งเป็นสิ่งที่ดีที่สุด ซึ่งสามารถใช้เป็นวิธีให้ข้อมูลเบื้องต้นของ EAEC ได้ การทดสอบการก่อตัวเซลล์ในสารปรุงแต่งเลือดเป็นแบบเชื้อ E.โคลรีเข้าไปใน M-H สารปรุงแต่งเลือดแบบเคลือง (Difco)35ถึง37°C ทำอุณหภูมิเลี้ยง18ถึง24h ในที่ที่เส้นผ่าศูนย์กลางเชื่อมตัวเซลล์เป็นเชิงบวก หรือบริเวณที่ลงตัวลงไปที่ด้านล่างของท่อสูงเพื่อให้เป็นลบ ในที่ที่หมุนเข้ากันทั่วไปเป็นลบ1996นักวิทยาศาสตร์อายุเด็ก Wang Mei ได้ทำการศึกษาการเข้ากันของเซลล์ของลำใจ-การทดสอบการเชื่อมตัวเซลล์ทางง่ายของ E.โคลรีที่มีความสัมพันธ์-H ซึ่งเป็นสิ่งที่ทดสอบการก่อตัวเซลล์ที่มีบทบาทสำคัญใน Hep-2ในการเปรียบเทียบการทดสอบการเชื่อมตัวเซลล์ พบว่าทั้งสองมีความเหมือนกัน77% หากรวมถึงแบบแพร่กระจายและแบบจำกัด จะมีอยู่88.5% ซึ่งแสดงว่าการทดสอบการก่อตัวเซลล์เป็นวิธีสุ่มที่น่าเชื่อถือในการตรวจสอบ EAggEC