Eins、采集标本
Mit einem sterilen Wattestäbchen den Stuhl des Diarrhoe-Patienten abtropfen, wenn kein Stuhl vorhanden ist, mit einem feuchtgehaltenen Phosphatpuffer-Afterstäbchen in den After einführen4~6cm(婴儿2~3cm) am After, nach dem Drehen und Wischen der Afteroberflächensekrete, das取出,盛于运送或保存液中,如果不能及时送检,样品应在4℃ im Kühlschrank lagern, aber nicht über8h ist为宜。
Zwei, Zucht und Isolierung
Für die Isolierung von Escherichia coli sollte bei der ersten Isolierung ein schwaches selektives Medium verwendet werden, wie Eosin Methyl Blue, China Blue Rosin Sorbit-MacConkey-Platte, Zeichnung Trennung,35~37℃ Kultivierung18~24h später, beobachten Sie die Merkmale der Kolonien, wählen Sie lila oder dunkelrote, Größe1~3mm, mit glatten, glänzenden Rändern und einer erhabenen Einzelsorte, die identifiziert wird.
Drei、鉴定
1、初步鉴定:Nach den Kolonienmerkmalen, der Färbung der Bakterien und der Färbungsreaktion, wird die rein kultivierte Bakterienprobe biochemische Reaktionen durchführt, alle, die den entsprechenden Ergebnissen entsprechen, können zunächst als Escherichia coli identifiziert werden.
2、最终鉴定:Allgemeine Routineprüfungen sind ausreichend für die erste Bestimmung, bei Bedarf kann die endgültige Bestimmung nach den biochemischen Reaktionen in der "Berge Systematischer Bakteriologie Handbuch" vorgenommen werden.
3、Bestätigungstest:Einige Escherichia coli, insbesondere die nicht motilen, nicht fermentierenden Lactose-Stämme, sollten mit Shigella unterschieden werden. Die Hauptunterscheidungstests sind der Acetat- und Glucose-Aminutilisierungs-Test sowie die Säureproduktion aus Mucin.3e Test, Escherichia coli sind alle positiv und Shigella ist negativ.
(1)Pathogene Escherichia coli:
A, Annahmetest: Aus den dicht wachsenden Kolonien auf der Identifikationsplatte wird eine Kulturen ausgewählt, mit der EPEC3e Vielfach O Serum zur Durchführung von Platte- und Einröhrchen-Agglutinationsversuchen, wenn mit einem bestimmten Vielfach O Serum agglutiniert wird, wird mit dem O Einheit Serum des Vielfach O Serum getestet, wenn mit einem bestimmten O Einheit Serum agglutiniert wird, wird eine weitere Kolonie ausgewählt3~5e einzeln isolierte Kolonie, die mit dem Serum agglutiniert wird.
B, Biochemischer Test: Die Kolonien, die stark agglutiniert werden von O Einheit Serum, werden in den Trisaccharose-Gelatine-Agar injiziert, die Indol-Testfolie gehängt36℃ Kultivierung18~20h, alle Lactose, Saccharose sauer werden, Glucose sauer wird und viel Gas produziert, H2S-negativ, Indol positiv, kann dies als Escherichia coli bestätigt werden. Wenn Indol negativ ist, muss auch V-P-Test negativ und nicht wachsend auf Simons Citrat-Agar, kann dies als Escherichia coli bestätigt werden.
C, Serologische Bestätigungstest: Der Kulturen auf dem Trisaccharose-Gelatine-Agar werden mit physiologischem Salzwasser in Suspension gebracht, verdünnt bis zu einer Konzentration von MacFarland3erheitertes Konzentration, 0 Einheit Serum, wenn die ursprüngliche Effizienz in1∶(160~320), dann kann1∶40 verdünnt (mit 0.5% Salzwasser), in10mm×75mm Röhrchen, die verdünnte Antiserum und die Bakterien Suspension werden in gleicher Menge gemischt, in50.6℃ Wasser temperatur16h后观察结果,如果出现凝集,可证实为该O因子。
(2)Hämorrhagische Escherichia coli:已知为出血性肠炎患者的粪便,可划线接种以山梨醇代替乳糖的麦康凯琼脂平板,经培养后,挑选3~5e Kolonien, die Sorbitol nicht fermentieren, mit O157Serum (besser noch mit H7Serum) zur Durchführung von Platte- und Einröhrchen-Agglutinationsversuchen, um die Diagnose zu bestätigen.
Die isolierten Stämme sollten in den Trisaccharose-Gelatine-Agar injiziert und die Indol-Testfolie gehängt werden36℃ Kultivierung18~20h, alle Lactose, Saccharose sauer werden, Glucose sauer wird und viel Gas produziert, H2S-negativ, Indol positiv und die Reaktionsröhrchen für Sorbitol Fermentation werden angewendet, als verlangsamte Fermentation.
(3)Toxine producing Escherichia coli:
A, Biochemischer Test: Es wird aus den identifizierenden Platten eine flüssige Kolonie ausgewählt5e, typische Kolonien der Lactose-Gärung werden in der Regel ausgewählt, einzeln in den Trisaccharose-Gelatine-Agar injiziert, die Indol-Testfolie hängt36℃ Kultivierung18~20h, alle Lactose, Saccharose sauer werden, Glucose sauer wird und viel Gas produziert, H2S-negativ, Indol positiv, kann dies als Escherichia coli bestätigt werden. Wenn Indol negativ ist, muss auch V-P-Test negativ und nicht wachsend auf Simons Citrat-Agar, kann dies als Escherichia coli bestätigt werden.
B, Toxin-Produktionstest: Die pathogenen Escherichia coli werden hauptsächlich durch den Toxin-Produktionstest bestätigt. Es gibt viele Methoden für den Toxin-Produktionstest, in China wird derzeit die Zwillingsagarpfropfungsprobe zur Bestimmung von LT und die Milchmäuse-Gaumenspülungsprobe zur Bestimmung von ST verwendet. Manchmal wird auch der Versuch mit einem verbandenem Ileumabschnitt eines Haushuhns zur Bestimmung von LT und ST verwendet.
当前已有采用基因诊断法测定这两种肠毒素。
a、双向琼脂扩散试验:将被检菌株按5点环形接种于Elek培养基上,以同样操作,共做两份,于36℃ Kultivierung48h,在每株菌的菌苔上放一片多黏菌素B纸片,于36℃经5~6h,使肠毒素渗入琼脂中,在离菌苔各5mm处的中央,挖一个直径4mm的圆孔,并用一滴琼脂垫底,在孔内滴加LT抗毒素30μl,并用已知产LT和不产毒菌株作对照,于36℃ Kultivierung15~20h观察结果,在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性,否则为阴性。
b、乳鼠灌胃试验:将被检菌株接种于Honda产毒肉汤内,于36℃ Kultivierung24h,3000r/min离心30min,取上清液经薄膜滤器过滤,60℃加热30min,每毫升滤液内加入2%伊文思蓝溶液0.02ml,将此滤液用塑料小管注入1~4天龄的乳鼠胃内0.1ml,同时接种3~4只,禁食3~4h后用氯仿麻醉,取出全部肠管,称量肠管(包括积液)重量及剩余的体重,肠管重量与剩余体重之比大于0.09为阳性,0.07~0.09为可疑。
c、家兔结扎回肠段试验:将被检菌株接种于Honda产毒肉汤,于36℃ Kultivierung24h,3000r/min离心30min,取上清液经薄膜滤器过滤,滤液分成两份,一份不加热,供测LT用;另一份60℃加热30min,供测ST用,取体重2kg家兔,禁食1天,麻醉后剖腹,取出回肠段,按10~15cm为一段,分段结扎,取一段注射肉汤2ml作为阴性对照,另一段注射已知产毒菌肉汤培养物的滤液2ml作为阳性对照,其他各段分别注射待试菌株肉汤培养物的滤液2ml,将腹壁缝合,测定ST时,于注射后6~8h剖腹检查;测定LT时,于注射后18h剖腹检查,抽取各肠段内的滤液,测定其容量,并测定肠段的长度,积液量(ml)与肠段长度(cm)之比大于1为阳性。
d、血清学试验:肠毒素试验阳性菌株可用ETEC有关的多价O血清及单价血清作玻片凝集试验,以确定其O抗原。
(4)侵袭性大肠埃希杆菌:
A、生化试验:于鉴别平板上挑取菌落3~5个,一般应多挑取与志贺菌相似的不发酵乳糖的菌落,但发酵乳糖的优势菌落亦可适当挑取,将挑取的菌落接种半固体管,36℃ Kultivierung18~24h,有动力的菌株一般可以弃去,除非经血清学鉴定为0124,留下无动力的菌株,接种三糖铁琼脂,悬挂靛基质试纸片,36℃ Kultivierung18~20h, gleichzeitig mit dem Lysindecarboxylase-Test, die typischen biochemischen Eigenschaften von EIEC sind: Lactose, Sucrose wird nicht sauer oder sauer, Glucose wird sauer, Gas wird erzeugt oder nicht erzeugt, H2S-negativ, Indol positiv, Lysindecarboxylase-negativ, außer O124Außen sind keine Motilität, Lysindecarboxylase-Test kann auch nach der Serologischen Tests durchgeführt werden.
B、Serologische Tests: Einige Triphenylalanin-Agar-Kulturen werden ausgewählt, mit zwei Polysaccharid-O-Serum von EIEC als玻片agglutinationstest durchgeführt, um die Komponenten des O-Antigens zu bestimmen.
C、Hundekorne-Test: Die Bakterienflüssigkeit wird in das Auge des Kaninchens getropft2~5Tage beobachtet werden, ob Rötung, Tränenfluss und Schwellung auftreten.
D、ELISA-Test: Mit bekannten Toxinstämmen von EIEC oder Shigella species immunierten Kaninchen, die erhaltenen Immunserum mit den gleichen toxischen Stämmen adsorbiert, mit ELISA-Methode gemessen, die toxischen Stämme von EIEC und Shigella species sind alle positiv, diese Methode ist zur Detektion der invasiven Peptide des zu untersuchenden Bakteriums, kann auch die Methode der Gendetektion mit DNA-Fingerabdruck verwendet werden.
(5)Aggregierte Escherichia coli: Eine wichtige Eigenschaft der aggregierten Escherichia coli (EAEC) ist, dass sie auf dem Hap-2um eine spezifische Aggregationsadhäsion um die Zellen zu bilden, Yamamoto fand in37℃ kultiviert, kann die Aggregationsadhäsion von EAEC in bestimmten Oberflächen des Flüssigkulturmediums auftreten,形成很厚的粘附聚集性菌块,在25℃ oder42℃ gibt es dieses Phänomen nicht, das Flüssigkulturmedium ist mit L oder M-H-Kulturmedium ist das Beste, das als eine vorläufige Identifikationsmethode für EAEC dienen kann, der Test zur Bildung von Bakterienklumpen im Flüssigkulturmedium: Escherichia coli wird in M-H-Flüssigkulturmedium (Difco),35~37℃ Inkubation18~24h, alle Bakterienklumpen, die auf der Oberfläche (Teilweise Absinken des Endes des Rohres) gebildet werden, sind positiv, und alle gleichmäßig trüben, bakterienfreien Klumpen sind negativ1996Jian Wang Mei und andere zu den intestinalen Aggregaten-Adhäsive Escherichia coli durch einfache Screening-Tests zu screenen, die M-H-Kulturmedium auf der Bildung von Bakterienklumpen im Hep-2Vergleich der Zelladhäsionsversuche, die Übereinstimmungsraten beider erreichen77%, wenn Diffusions- und Läsionsformen enthalten sind, dann bis88.5%, was zeigt, dass der Test zur Bildung von Bakterienklumpen ein zuverlässiges Screeningverfahren für EAggEC ist.